Cloning and expression of Neospora caninum rhoptry 2 and its potential as an immunobiological for neosporosis control

ABSTRACT: The protozoan Neospora caninum is known worldwide as one of the main causes of abortion in cattle. During infection, rhoptry proteins present in the apical complex of the parasite play important roles in adhesion and parasitophorous vacuole formation. The use of N. caninum ROP2 in experimental vaccines has shown promising protective results. In our study we performed cloning and expression in Escherichia coli of an antigenic portion of N. caninum ROP2. The recombinant protein (rROP2) was obtained in insoluble form, and the purified protein showed a size of approximately 18kDa. Even being a small truncate NcROP2 region, it was possible to conserve the antigenic epitopes which were recognized by bovine serum naturally infected with N. caninum. Vaccination with rROP2 on aluminum hydroxide adjuvant induced high levels of rROP2-specific IgG antibodies capable of recognizing native protein in tachyzoite lysates. In conclusion, our approaches were effective in obtaining the rROP2 protein, which induced specific mouse immune response and was also recognized by sera from N. caninum naturally infected cattle. These results suggest that it is a promising antigen for the development of neosporosis subunit vaccines as well as a suitable antigen for use in immunodiagnosis.

RESUMO: O protozoário Neospora caninum é conhecido mundialmente como uma das principais causas de aborto em bovinos. Durante a infecção, as proteínas rhoptry presentes no complexo apical do parasita desempenham papel importante na adesão e formação de vacúolos parasitóforos. O uso de ROP2 de N. caninum em vacinas experimentais tem mostrado resultados de proteção promissores. Em nosso estudo, realizamos a clonagem e expressão em Escherichia coli de uma porção antigênica de N. caninum ROP2. A proteína recombinante (rROP2) foi obtida na forma insolúvel, e a proteína purificada apresentou tamanho aproximado de 18kDa. Mesmo sendo uma pequena região truncada de NcROP2, foi possível conservar os epítopos antigênicos que foram reconhecidos pelo soro de bovinos naturalmente infectados com N. caninum. A vacinação com rROP2 adsorvida no adjuvante de hidróxido de alumínio induziu altos níveis de anticorpos IgG anti-rROP2, capazes de reconhecer a proteína nativa em lisados de taquizoítos. Em conclusão, nossas abordagens foram eficazes na obtenção da proteína rROP2, que induziu resposta imune específica em camundongos e também foi reconhecida por soros de bovinos naturalmente infectados com N. caninum. Estes resultados sugerem que rROP2 é um antígeno promissor para o desenvolvimento de vacinas de subunidades de neosporose, bem como um antígeno adequado para uso em imunodiagnóstico.

Cloning and expression of Neospora caninum rhoptry 2 and its potential as an immunobiological for neosporosis control / Clonagem e expressão de rhoptry 2 Neospora caninum e seu potencial como um imunobiológico para o controle de neosporose

The protozoan Neospora caninum is known worldwide as one of the main causes of abortion in cattle. During infection, rhoptry proteins present in the apical complex of the parasite play important roles in adhesion and parasitophorous vacuole formation. The use of N. caninum ROP2 in experimental vaccines has shown promising protective results. In our study we performed cloning and expression in Escherichia coli of an antigenic portion of N. caninum ROP2. The recombinant protein (rROP2) was obtained in insoluble form, and the purified protein showed a size of approximately 18kDa. Even being a small truncate NcROP2 region, it was possible to conserve the antigenic epitopes which were recognized by bovine serum naturally infected with N. caninum. Vaccination with rROP2 on aluminum hydroxide adjuvant induced high levels of rROP2-specific IgG antibodies capable of recognizing native protein in tachyzoite lysates. In conclusion, our approaches were effective in obtaining the rROP2 protein, which induced specific mouse immune response and was also recognized by sera from N. caninum naturally infected cattle. These results suggest that it is a promising antigen for the development of neosporosis subunit vaccines as well as a suitable antigen for use in immunodiagnosis.(AU)

O protozoário Neospora caninum é conhecido mundialmente como uma das principais causas de aborto em bovinos. Durante a infecção, as proteínas rhoptry presentes no complexo apical do parasita desempenham papel importante na adesão e formação de vacúolos parasitóforos. O uso de ROP2 de N. caninum em vacinas experimentais tem mostrado resultados de proteção promissores. Em nosso estudo, realizamos a clonagem e expressão em Escherichia coli de uma porção antigênica de N. caninum ROP2. A proteína recombinante (rROP2) foi obtida na forma insolúvel, e a proteína purificada apresentou tamanho aproximado de 18kDa. Mesmo sendo uma pequena região truncada de NcROP2, foi possível conservar os epítopos antigênicos que foram reconhecidos pelo soro de bovinos naturalmente infectados com N. caninum. A vacinação com rROP2 adsorvida no adjuvante de hidróxido de alumínio induziu altos níveis de anticorpos IgG anti-rROP2, capazes de reconhecer a proteína nativa em lisados de taquizoítos. Em conclusão, nossas abordagens foram eficazes na obtenção da proteína rROP2, que induziu resposta imune específica em camundongos e também foi reconhecida por soros de bovinos naturalmente infectados com N. caninum. Estes resultados sugerem que rROP2 é um antígeno promissor para o desenvolvimento de vacinas de subunidades de neosporose, bem como um antígeno adequado para uso em imunodiagnóstico.(AU)

Imunobiologia e imunoterapia em câncer humano: experiência em avaliação de hipersensibilidade cutânea celular tardia e imunoterapia ativa inespecífica com bacilo calmette-guérin cepa Rio de Janeiro

O autor mostra o desenvolvimento histórico da imunobiologia e imunoterapia dos tumores malignos no homem e em sistemas animais, destacando-se expressões antigênica e química e fundamentos imunobiológicos de tumores malignos humanos, Foram apresentados os mecanismos de resposta do sistema imune por rede de regulação de reconhecimento associativo e não-associativo, a resposta imune provocando estímulo ao crescimento neoplásico, as teorias da vigilância imunológica, as relações tumor-hospedeiro e resistência ao tumor estabelecido, os mecanismos de defesa e resistência do tumor estabelecido e o desenvolvimento do processo metastático. Procura-se mostrar de forma crítica o estado atual e perspectivas em imunoterapia de câncer humano. São discutidos estudos de hipersensibilidade cutânea celular tardia com antígenos primários e de memória em indivíduos normais considerando-se o processo de envelhecimento, o comportamento da reatividade cutânea celular tardia em tumores sólidos malignos e a influência da vacinação, radioterapia e cirurgia sobre a hipersensibilidade cutânea tardia de portadores de tumores sólidos malignos. Em imunoterapia de câncer humano, são apresentados resultados com BCG-Rio de Janeiro em imunoterapia loco-regional, imunoterapia endovenosa e quimioimunoterapia de melanoma maligno avançado e adenocarcinoma gástrico avançado. Foram estudados ao todo quatrocentos e três pacientes

The author presents a historical development of immunobiology and immunotherapy of malignant tumors in human and animal systems, with a special concern to the antigenic and chemical expression of human malignant tumors and its fundamental immunobiology. It has been discussed the immune system mechanisms and its response via associative and nonassociative recognition network regulation, the tumor growth stimulated by immune response, immunosurveillance theories, the host-tumor relationship and resistance to the established tumor and development of the metastatic process. Present status, perspective of human cancer immunotherapy and a critical review are also presented. In vivo assays of delayed cutaneous cellular hypersensitivity reaction to the primary stimulus of 2, 4-dinitro-chlorobenzene (DNCB) and the recall reactions to common microbial are dis cussed including aging, delayed hypersensitivity skin reaction to malignant solid tumor, and the influence of vaccination, radiotherapy and surgery on delayed hypersensitivity skin reaction of patients with malignant solid tumors. Results to BCG-Rio de Janeiro strain in loco-regional immunotherapy, intravenous immunotherapy and chemoimmunotherapy to advanced malignant melanoma and advanced gastric adenocarcinoma in man are discussed. It has been studied four hundred and three patients